一线科学家现身！五分钟看懂“舞蹈症猪”

北京时间年3月30日凌晨，生物学顶尖学术期刊《Cell》在线发表，我国科学家领衔的国际研究团队首次利用基因编辑技术和体细胞核移植技术，成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈症基因敲入猪。

这是继世界首只转基因亨廷顿病猴模型之后，由中国科学家主导，在猪模型上取得的重大科学突破，这个首例“舞蹈症猪”能精准地模拟人类神经退行性疾病——亨廷顿舞蹈病，为我国脑科学与类脑研究提供了最新手段，也标志我国大动物模型研究走在了世界前列。

什么是亨廷顿舞蹈症　

亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等是当今社会严重威胁人类健康的神经退行性疾病。这些疾病伴随年龄渐长而产生、可遗传、呈渐进性发展，由于缺乏合适的动物模型进行药物筛选，目前尚无有效的治疗方法。

李晓江介绍，神经退行性疾病是致病蛋白变异后沉淀在神经细胞中，造成神经细胞功能紊乱，并引发神经细胞死亡，从而导致疾病发生。而亨廷顿舞蹈病是由单基因（HTT）突变导致的神经退性疾病。这是一个理想的疾病模式，可用于研究蛋白质错误折叠如何引起选择性的神经退性病变，是以后研究多基因突变病症的基础。

寻找合适的疾病实验模型

小鼠作为最常见的动物模型，已被广泛地用于研究人类疾病机理和寻找临床治疗方法。李晓江团队在研究中发现，表达突变基因的神经退行性疾病小鼠模型，并不能表现出像病人脑中一样的典型神经细胞死亡的重要病理特征。许多有治疗效果的药物在小鼠模型中有效，在临床上对病人往往无效。为了探索动物模型，他开始把目光转移到大动物、非人灵长类动物身上。

早在年，“夫妻档”科学家李晓江、李世华在美国Emory大学合作者的支持下，通过将外源性的突变基因引入到猕猴的体内，成功地建立了世界首只转基因亨廷顿病猴模型。李晓江说，在该模型中，可以明显地观察到相应的病理特征和行为变化，但表达外源性致病基因片段的毒性过强。实验中的转基因猴子基本在出生后较短时间内死亡，同时无法传代。因此，转基因亨廷顿病猴模型无法达到筛选治疗疾病的药物的目的。

为何选择猪

位于广州九龙镇的“猪宾馆”，记者看到，科学家们正精心饲养着一群身价不菲的实验小猪。与果蝇、线虫、小鼠等小型动物相比，猪被公认为是人类医学研究理想的大动物模型。赖良学解释，猪的心血管系统、消化系统、皮肤、营养需要、骨骼发育以及矿物质代谢等都与人的情况极其相似，猪的体型大小和驯服习性允许进行反复采样和进行各种外科手术。

赖良学提到，与非人灵长类动物相比，猪的基因多样、繁殖周期短、一窝产仔多，便于根据特殊需要进行选育，又不存在伦理学方面的问题。所以，猪的疾病模型用于做药物筛选、人类疾病研究、干细胞治疗的研究结果，更容易转化为临床应用。

作为华南地区重要的大动物疾病模型实验平台之一，赖良学团队先后建立了20余种在生物医药和农业领域具有重要价值的转基因和基因打靶克隆猪。年，这对“夫妻档”找到了赖良学，一拍即合，他们合作建立了首例转基因亨廷顿病猪模型。

“猪八戒”成为科学家掌中宝

大胆的科学设想

摆在科学家面前的是一个难题，与转基因亨廷顿病猴模型一样，猪模型也具有明显的表型特征，但不易存活，无法传代。这一问题，曾一度令他们感到非常困扰。李世华说，“人是在某个定点基因突变而导致亨廷顿疾病，而目前转基因技术是随机性的将外来的变异基因插入动物的基因组，其表达量也高于内源性致病基因。”

团队进而分析，直接把猪的内源性基因改变为突变基因，猪的病理变化应该与病人的病理状态更接近。然而，基因敲入的效率太低，在大动物中很难获得。年，随着基因编辑技术（CRISPR/Cas9）被广泛应用于哺乳动物中，在广东省科技计划的支持下，他们大胆尝试这一科学设想，李世华着手应用Cas9技术来建立亨廷顿基因敲入猪模型。团队通力合作，利用基因编辑技术（CRISPR/Cas9），将人突变的亨廷顿基因插入到猪的内源性亨廷顿基因的表达框中，即人外显子1中包含CAG重复序列精确地插入猪的HTT内源性基因中。

能够成功关键还看实验进展，利用成纤维细胞筛选出阳性克隆细胞，这并非一件易事，“单细胞逐个挑出来并进行筛选及鉴定，一定要挑选状态最好的细胞用来胚胎移植”。负责此项实验工作的闫森先后筛选了上千个细胞，从中挑出确定带有突变基因且状态最好的细胞，闫森说，“每天早上7点进入细胞间，看细胞、换液、不停地跟细胞打交道，一抬头已是下午3点。好不容易筛选到的阳性克隆细胞如果状态不好又得重来，只有大量筛选才能获得最优的细胞克隆。很快，实验进入下一步，他们运用体细胞核移植技术进行克隆，成功培育带有突变基因的新生猪。在历经5个月的观察后，亨廷顿猪出现了运动障碍等渐进性发病的表型。下一步就是将稳定表达的基因敲入亨廷顿猪繁殖下去。由于疾病模型猪身体状态不好，在传代过程中更需要悉心的照料。终于在团队的呵护下F1代小猪出生了。为了证明亨廷顿基因敲入猪的病理特征更接近于人类。李世华多次从美国返回国内亲自指导实验，到猪场看小猪的生存环境及生活状态。

小心的求证

实验结果传来，他们成功了！其结果验证，该模型不但能够模拟亨廷顿病患者在大脑纹状体的神经元选择性死亡的典型病理特征，在行为上也表现出类似亨廷顿病“舞蹈样”的异常行为。难能可贵的是，这些病理及行为学表型都可以稳定地遗传给后代。

作为世界首例亨廷顿病猪基因敲入模型，它表明在模拟病人的神经病理变化特别是脑疾病方面，大动物模型比小动物模型更具优势。

“猪八戒”成为科学家掌中宝

科学家联手，4年带来“它”的诞生

科学家利用基因编辑（CRISPR/Cas9）技术，精准地将人突变的亨廷顿基因，即人外显子1中包含CAG重复序列精确地插入猪的HTT内源性基因中，利用成纤维细胞筛选出阳性克隆细胞，并通过体细胞核移植技术，成功培育出亨廷顿舞蹈病的基因敲入猪模型，在国际上首次建立了与神经退行性病人突变基因相似的大动物模型。

研究发现，该模型不仅能模拟亨廷顿舞蹈症病人在大脑中特异神经元选择性死亡的典型病理特征，而且表现出类似亨廷顿舞蹈病“舞蹈样”的异常行为。更重要的是，这些病理特征及异常行为都可以稳定地遗传给后代。

10年尝试，经历鼠猴猪，现在胜出的竟然是猪？

小鼠，是最常见的动物模型，已被广泛地用于研究人类疾病机理和寻找临床治疗方法。但本次研究的共同作者李晓江发现，表达突变基因的神经退行性疾病小鼠模型，并不能表现出像病人脑中一样的典型神经细胞死亡的重要病理特征。许多有治疗效果的药物在小鼠模型中有效，在临床上对病人往往无效。于是，科学家开始把目光转移到大动物身上。

而早在年，李晓江和同为人类遗传学教授的夫人李世华（ShiHuaLi）在美国Emory大学合作者的支持下，通过将外源性的突变基因引入到猕猴的体内，成功地建立了世界首例转基因亨廷顿病猴模型。在该模型中，可以明显地观察到相应的病理特征和行为变化。但是，表达外源性致病基因片段的毒性过强，实验中的转基因猴子基本在出生后较短时间内死亡，同时无法传代。因此，没有办法达到筛选治疗疾病的药物的目的。

最终，他们找到了现在的实验对象——猪。研究团队通力合作，经过4年的努力，利用基因编辑（CRISPR/Cas9）技术，精准地将人突变的亨廷顿基因插入猪的HTT内源性基因中，并通过体细胞核移植技术，成功培育出亨廷顿舞蹈病的基因敲入猪模型。

世界领先！中国科学家造福人类

文章共同第一作者为暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院闫森副研究员和涂著池博士、中国科学院广州生物医药与健康研究院刘朝明。中山大学、吉林大学、云南农业大学的科学家们也参与了该工作。

中科院院士裴钢教授在得知该成果发表后指出，在国家的前瞻性布局下，我国在基因编辑猴和克隆猴的研究中相继取得突破性成果，这次我国科学家在猪的疾病模型研究中又取得重大进展，表明我国在大动物模型的研究中已走在世界前列，将极大地推动我国生物医药产业的创新发展。

从事多年研究亨廷顿病的权威专家、美国加州大学洛杉矶分校杨向东(X.WilliamYang)教授指出，亨廷顿舞蹈病基因敲入猪的建立是神经退行性疾病研究领域中的一个里程碑式的发现,使科学家能更深入了解神经细胞死亡的机制及寻找有效的治疗方法。

为人类试药造福于人类

神经疾病基因敲入猪的成功，将推动我国发展出大动物疾病模型的医药研发产业链，促进针对阿尔茨海默病、帕金森症等神经退行性疾病，以及免疫缺陷、肿瘤、代谢性疾病的新药研发进程。同时，该动物模型可用于干细胞治疗等手段的临床前评价，最终造福于人类。

专家点评

杨辉（中科院神经科学研究所研究员，青年千人）

本项工作第一次应用基因敲入模型在大动物上很好的模拟了亨廷顿疾病，更真实的重现了人类亨廷顿疾病的一些表型，为将来在该模型上开发细胞治疗、基因治疗以及筛选药物等提供的有力支持。李晓江教授和李世华教授曾与AnthonyChan等合作在在年运用慢病毒介导的HTT突变体过表达转基因猴模型成功的模拟了亨廷顿疾病模型，但是因为基因随机整合，拷贝数过多，每只猴子表型不一且过重。随着克隆猴技术的出现，再结合基因编辑技术，在猴模型上更真实的模拟人类疾病成为可能。值得注意的是，第一代克隆猪（即F0代）也能很好的模拟人亨廷顿疾病，说明在克隆动物上重现人类某些疾病的表征是可行的，这很好的解决了猴模型繁殖力低、繁殖周期长的缺点。值得一提的是，赖良学团队建立在基因修饰克隆猪模型有着很好的声誉，结合李晓江、李世华团队多年在神经退行性疾病的多年经验，这种强强结合的模式，出好的成果是必然的！