Qi皮质-运动通路（cortico-motorpathway）的主要功能是调节后脑和脊髓的神经活动，以产生协调运动。大脑皮层中的皮质下行谷氨酸能神经元发送长程轴突来调节后脑和脊髓的网络，最终诱导肌肉收缩。而外伤、肌萎缩性侧索硬化症或自身免疫性疾病后皮质运动回路的损伤或退化会导致严重的运动功能障碍。诱导性多能干细胞在建立个性化疾病模型方面有广阔前景，尽管皮质-脊髓-运动通路的组分已在分离情况下产生及研究，但这一系统的体外衍生和装配尚未在人类细胞中实现。先前，已经开发出生成特定区域的球状体（spheroids）或类器官（organoids），并在体外将其融合成为三维装配体（3Dassembloids），来模拟人脑发育过程中复杂的细胞相互作用。截至目前，尽管已在皮质-丘脑装配体、器官型小鼠共培养和使用切片皮质类器官和啮齿类动物脊髓外植体的制备中观察到了长程神经投射，然而，在体外从人类细胞中衍生出和组装完成功能性多突触回路的想法尚未实现。近日，来自美国斯坦福大学医学院的SergiuP.Pa?ca课题组在Cell杂志上发表了一篇题为GenerationofFunctionalHuman3DCortico-MotorAssembloids的文章，在这项研究中，作者获得类似于大脑皮层和后脑/脊髓的类器官，并将它们与人类骨骼肌类器官组合在一起，产生3D皮质-运动装配体，并通过狂犬病追踪、钙离子成像和膜片钳记录等手段，证实皮质下行神经元投射与脊髓类器官相连，而脊髓源性运动神经元与肌肉相连这一通路。此外，谷氨酸释放（Glutamateuncaging）或对皮质球状体的光遗传刺激可引起3D肌肉的强烈收缩，而装配体在形态和功能上均可在融合后10周内保持完整。总之，该系统突出了3D培养物的显著自组装能力，以及潜在的可用来了解人类发育和疾病功能回路的能力。首先，作者调整不同方案以从人类诱导性多能干细胞（human-inducedpluripotentstem,hiPS）中生成类似人类后脑/颈脊髓(hindbrain/cervicalspinalcord,hSpS)的球状体，并通过不同的神经元标志物进行验证。为了生成皮质-脊髓装配体（cortico-spinalassembloids），作者将hSpS与感染AAV-hSYN1::eYFP报告基因的人类皮质球状体（humancorticalspheroids,hCS）融合，于融合后5天通过实时成像观察到hCS中的细胞向hSpS延伸的过程，随后的免疫细胞化学也显示出hSpS中出现源自hCS的投射。图1.hCS-hSpS装配体的生成以及皮质-脊髓投射的表征为了确定源自hCS投射神经元的特异性，作者使用了逆行狂犬病毒追踪方法（retrograderabiestracingapproach），分别用携带Cre-eGFP重组酶的ΔG-狂犬病毒和携带跨突触传播所需的狂犬病毒糖蛋白(G)的AAV感染hSpS，以及使用编码DIO-mCherry的AVV感染hCS，并观察到hSpS和hCS中GFP的广泛表达。接下来，作者使用光遗传和钙离子成像来探测源自hCS的投射是否形成了功能连接，因此在组装前通过AAV病毒分别将光敏视蛋白Chrimson转入hCS，并将基因编码的钙指示剂GCaMP7s转入hSpS，通过光纤将短脉冲红光传递给hCS后约ms，十个装配体中有四个的hSpS神经元发生响应。与此同时，为了验证hCS的皮层神经元与hSpS的运动神经元突触连接，作者进一步在hCS-hSpS装配体上完成电压钳记录实验。作者通过使用AAV1-Syn1::Chrimson-mCherry感染hCS，并使用hSpS中的Hb9::GFP报告基因可视化运动神经元，发现连续的光刺激Hb9+细胞周围区域可以产生可靠的突触后电流，而这些反应可能被TTX阻断，这表明它们可能是由单突触或双突触连接的hCS神经元轴突的动作电位触发的。这些数据提示，hCS中的皮质下行神经元与hSpS中的神经元产生了突触连接。皮质-运动回路的功能输出是通过运动神经元活动的肌肉收缩实现的，为了探讨hSpS调节人体肌肉细胞活动的能力，作者使用从成人肌肉活检中提取的人类骨骼成肌细胞(weusedhumanskeletalmyoblasts,hSkM)，并将hSpS置于贴壁培养的hSkM之上。使用钙指示物Cal-活体成像，作者发现hSpS-hSkM中活性hSkM的比例比hSkM单独培养或与hCS共培养的hSkM增加了一倍。随后，作者将完整的hCS与hSpS和hSkM融合并验证自发性收缩在hSkM中的存在，类似地，hSpS-hSkM和hCS-hSpS-hSkM装配体相较于hSkM单独或hCS-hSkM装配体而言显示出更多的自发性收缩。此外，谷氨酸解笼锁以光刺激装配体中的hCS会引起强烈的肌肉收缩反应，这提示皮质-脊髓-肌肉功能性单元的装配成功，相反，如果仅刺激hCS-hSkM中的hCS不会引起反应，表明皮层刺激后的引发的肌肉收缩依赖于hSpS的存在。由于这些实验的hSkM来源于成人肌肉，作者想知道这一装配体是否可以完全来源于hiPS细胞？作者通过生成hiPS细胞来源的骨骼肌成肌细胞（ihSkM），依照上述在原代成肌细胞中完成的程序，并生成完全hiPS细胞来源的功能性装配体。传统的运动神经元和肌肉共培养并不适合长期实验，因为随着时间的推移细胞往往会发生分离。然而，在这项研究中，作者发现hCS-hSpS-hSkM装配体可以保持在培养环境中长达10周而不发生结构解体。那么在这期间，装配体的功能性是否会随时间推移而降低呢？为此，作者生成hSCAAV-Chrim-hSpS-hSkM装配体，并在第5周和第8周进行光刺激，结果显示hSkM在两个时间点都发生收缩，尽管在第8周时收缩率有所下降，然而在连续5次刺激之后，第8周时的装配体更有可能发生反复收缩，提示长期培养后反应更强烈。这篇文章的通讯作者，精神病学和行为科学副教授SergiuPasca表示：“ALS在啮齿类动物身上已经治愈了几十次，然而没有一种疗法能有效地转化到人类患者身上。但现在我们可以利用患者自己的细胞生成个性化的工作模型，帮助我们在培养皿中研究这些疾病”。这番话正巧也是这项工作的重点及亮点所在，研究人员所建立的皮质-运动装配体可用于追踪解剖和功能连接，能够在体外长期维持以捕捉细胞和功能的变化，并可在多个层面进行光遗传或药理学操作以控制人体肌肉收缩。由此扩展到中枢神经系统不同区域的装配体构建，可以为理解不同类型的人体回路的装配和识别治疗策略带来深刻的见解。原文链接：

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