脊髓性肌萎缩症（SMA）是由SMN1中的有害变异引起的进行性运动神经元疾病，其导致存活运动神经元（SMN）蛋白表达的显着降低。人类有第二个SMN基因（SMN2）几乎与SMN1相同。然而，由于可变剪接，大多数SMN2信使核糖核酸（mRNA）被翻译成截短的，不稳定的蛋白质，其迅速降解。因为SMN2的存在为SMA患者的治疗发展提供了独特的机会，调节SMN2的机制剪接和mRNA表达已经非常详细地阐明。相反，在不同发育时间点和不同组织中产生多少SMN蛋白质仍然未被充分表征。在这项研究中，我们通过确定6个不同小鼠组织和SMA的两个不同小鼠模型。我们发现，在健康对照小鼠中，SMN蛋白表达受年龄和组织类型的显着影响。当比较SMA的小鼠模型时，我们发现，尽管从遗传上不同的等位基因转录，控制SMN水平相对相似。相反，SMA中组织之间SMN消耗的程度随时间和两种模型之间显着变化。这些发现为SMA中观察到的组织和器官的不同脆弱性提供了解释，并进一步了解了SMN的系统和时间要求，这与开发SMA的有效疗法直接相关。

介绍

脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种进行性运动神经元疾病。最常见的SMA形式（约占所有病例的50%;I型）发生在婴儿中，其特征是在6个月之前发病，并且在未治疗时，在2岁之前导致死亡。SMA由SMN1的纯合缺失（~95%）或SMN1中的其他突变（~5%）引起，导致运动神经元（SMN）蛋白表达的丧失。人类有第二个SMN基因（SMN2）几乎与SMN1相同。然而，由于外显子7的5末端的C-to-T转换，外显子7通过拼接来自大多数SMN2。转录物（，4）。截短的SMN2信使核糖核酸（mRNA）产物被翻译成不稳定的蛋白质，其迅速降解。相反，少数（~10%）SMN2衍生的mRNA包括外显子7，其随后被翻译成全长的稳定SMN蛋白。人类基因组中SMN2拷贝的数量是可变的，因此，SMN2拷贝数是SMA表型的主要决定因素：更高数量的SMN2拷贝与更高水平的全长SMN相关，而后者则相关与观察到的临床表型一致。因此，SMN2的存在为治疗开发提供了独特的机会，并且已经非常详细地研究了调节SMN2剪接的机制。令人兴奋的是，这导致最近批准nusinersen（Spinraza）治疗SMA。Nusinersen是一种鞘内递送的反义寡核苷酸，其靶向外显子7上游的内含子元件，导致外显子7的包含增加和全长SMN蛋白水平增加。这是一个里程碑式的发展，导致有意义的临床改善在一大群SMA患者。

相反，SMN蛋白在不同发育时间点和不同组织中的表达方式仍然知之甚少，但由于几个原因仍然很重要。首先，虽然SMA主要是运动神经元疾病，但其他细胞类型和组织受到不同程度的影响。这与组织之间不同的SMN要求有关的程度仍然未知;一般而言，RNA水平并不总是与蛋白质水平线性相关，并且从RNA翻译的蛋白质的量在组织之间变化。其次，更好地了解不同组织中相对SMN的要求将有助于指导SMA治疗的传递：例如，nusinersen目前直接传递给中枢神经系统（CNS），但这可能不足以达到最佳治疗效果。由SMN耗尽SMA（影响最后，最近的研究已经发现了许多细胞通路。虽然这些发现有助于推进我们对SMA发病机制的理解，但它们也表明了越来越需要确定导致SMA病理学的共同途径。生成时间和组织特异性SMN表达水平的参考数据集将有助于解释正在进行的功能研究并将其优先化为SMN耗尽的下游细胞后果。

结果

通过蛋白质印迹准确定量评估蛋白质水平需要精心控制，可重复且可靠的标准化方法，以解释转移效率和凝胶负载的差异。传统上，管家蛋白如肌动蛋白，微管蛋白和甘油醛--磷酸脱氢酶（GAPDH）已用于标准化蛋白质水平以用于定量目的但这些具有若干缺点。首先，管家基因的表达已经显示出在组织之间显着变化，这使得难以选择单个加载对照用于跨越一系列组织。此外，管家蛋白在发育过程中表现出不同的表达水平，这使得在不同发育时间点获得的蛋白质水平的比较变得复杂。最后，许多家用蛋白质已被证明可以改变疾病状况。事实上，几种常用的管家蛋白（肌动蛋白，微管蛋白和GAPDH）已被证明在SMA的细胞模型和在从SMA的小鼠模型。为了可靠地标准化蛋白质水平，因此优选允许定量加载的总蛋白质的总蛋白质染色（TPS）（例如考马斯，ponceauS或荧光可检测变异）。在本研究中，我们的目的是量化组织间和不同出生后发育时间点的蛋白质水平，我们利用基于激光扫描检测荧光标记的二抗和荧光TPS的灵敏，定量的蛋白质印迹方法。这使我们能够对组织内和整个出生后发育过程中的SMN水平进行标准化和量化（图1A）。

图1.用于确定SMN蛋白质水平的方法和小鼠模型。（A）从本研究中使用的两种小鼠模型收集的组织概述。通过定量蛋白质印迹分析的组织包括脑，脊髓，骨骼肌（M.gastrocnemius），心脏，肝脏和肾脏。（B）在本研究中使用台湾和Smn2B/-SMA模型。在台湾模型是基于人类转基因（SMN2），而的Smn2B/-模型是基于一个突变小鼠的Smn等位基因。从表面上看，两种模型都反映了SMA的核心特征，然而，台湾人显示更明显的全身表型，而Smn2B/-模型显示更清晰的神经肌肉表型。

首先，我们通过使用来自SMA的台湾小鼠模型的对照同窝小鼠来研究对照条件下的SMN蛋白水平。在该模型中，对照和SMA样小鼠是通过将小鼠Smn（Smn+/-）杂合的小鼠与携带两个等位基因和两个SMN2拷贝（Smn-/-;SMN2tg/tg）的Smn-null小鼠一起培育获得的。总4份SMN2上的同类系FVB背景。随后实验窝由~50%对照同窝仔组成（Smn+/-;SMN2tg/0，总一个等位基因小鼠Smn）两份SMN2）和~50%严重的SMA样同窝仔（Smn-/-;SMN2tg/0，没有小鼠Smn和两份SMN2）。控制同窝小鼠完全正常发育。严重的SMA类似的同窝小鼠最初与对照无法区分。然而，几天后出现严重的神经肌肉和全身表型，其特征是进行性的后肢麻痹和广泛的器官病变（图1B，左图）。疾病过程的时间在菌落之间略有不同，然而，我们的菌落小鼠在出生后第4天开始出现症状（P4），这种症状逐渐恶化并导致出生后8-9天的平均存活率（P8/P9）。因此，对于这项研究，我们将症状前的症状定义为P2，早期症状为P5，晚期症状为P8。

为了建立SMN表达的组织间变异性，我们在疾病相关时间点P2，P5和P8测定来自对照同窝小鼠（Smn+/-;SMN2tg/0）的三个生物重复中的SMN蛋白水平。我们研究了六种不同组织中的SMN表达：脑，脊髓，肌肉（腓肠肌），心脏，肝脏和肾脏（图2A和补充材料，图S1）。除了将SMN水平标准化为TPS之外，将样品标准化为内标以考虑膜之间的可变性。在该实验和随后的实验中使用的内标由P5脑裂解物的混合物组成（参见材料和方法以获得进一步的细节），并允许我们量化并直接比较每个研究组织中的SMN表达（图2B）。我们发现年龄对SMN表达的影响显着依赖于所研究的组织，反之亦然，组织对SMN表达的影响显着取决于所研究的年龄（P?0.）。为了进一步检验这种效应，我们进行了事后分析以确定个体P.-每个时间和组织比较的值（补充材料，表S1）。在P2，SMN水平在所有研究的组织中相对相似，除了在SMN水平显着较低的肝脏中。然而，在稍后的时间点，发生了SMN表达的显着不同的模式。从P2到P8，脑和脊髓SMN水平显着增加。相反，肌肉和肾脏中的SMN水平从P2降至P8，而心脏SMN水平保持不变。肝脏中的SMN表达始终显着降低。这些结果表明，在小鼠（Musmusculus）的出生后发育和成熟的正常过程中，SMN要求在神经组织和其他类型组织之间可能是不同的。

图2.对照组和台湾SMA小鼠SMN表达分析。（A）在所示组织中使用蛋白质印迹测定台湾SMA模型的对照同窝小鼠（Smn+/-;SMN2tg/0）中的SMN表达。显示的是内标（Int.St.），其对于所有组织是相同的并且在每个膜上一式三份加载，并且在每个指定时间点（P2，P5和P8）的每个组织的SMN表达。（B）来自（A）的所有组织中SMN表达的定量。首先将表达标准化为荧光TPS，然后归一化为Int。St.，允许膜之间的直接比较（n对于每个指定时间点的每个组织，=个生物学重复，±SEM）。每个时间点的所有组织都是从同一窝中获得的。（C）对于两种对照，在早期，早期和晚期症状年龄（P2，P5和P8）中显示每种指定组织的SMN表达（对于每种组织和每个时间点，n=，Smn+/-;SMN2tg/0）和SMA（每个组织和每个时间点n=，Smn-/-;SMN2tg/0）小鼠。（D）在每个时间点定量每个组织中的相对SMN消耗。首先将每个样品中的SMN表达标准化为荧光TPS。相对于对照，显示SMA同窝仔畜中的SMN表达。（E）在晚期症状时间点（P8），在两个独立窝中的六个组织中的每一个中测定SMN水平。kDa：40kDa分子量标记，参见未剪切的蛋白质印迹膜的补充材料。

在观察到对照小鼠中组织中SMN表达的惊人大变异性后，我们想确定SMA小鼠中是否存在类似的变异。为了评估这一点，我们确定了在P2，P5和P8的每个研究组织中SMA小鼠中SMN相对于对照同窝小鼠的量（图2C和补充材料，图S2）。通过首先将表达归一化至荧光TPS，然后将SMA中的SMN水平归一化至三个对照同窝小鼠的平均值，在三只SMA小鼠和三个对照中量化SMN水平（图2D，百分比参见图4C）。同样，我们观察到年龄对SMN表达的影响显着依赖于所研究的组织，并且组织对SMN表达的影响显着取决于所研究的年龄（P?0.）。进行事后分析以确定每个时间的个体P值和我们进行的组织比较（补充材料，表S2）。在心脏，肌肉和肾脏中，相对SMN表达对照SMN水平的5-10%，随着时间进一步降低。在肝脏中，SMA中相对SMN的表达显着高于心脏，肌肉和肾脏。在脑和脊髓中，在P2的SMA小鼠中存在显着更高的相对SMN水平，其随时间显着降低至P8。这与对照动物的SMN水平形成对比，其中SMN水平最初增加。这意味着对神经组织中SMN的特别高的要求，因此，SMN耗竭对神经组织的影响比对其他组织的影响要大。

最后，我们有兴趣了解单独的小鼠之间的SMN水平是如何可重复的。因此，我们在第二个独立的垫料中确定P8处的SMN表达水平（图2E），并将SMN水平与之前获得的水平进行比较（图2D）。虽然我们观察到一些适度的垫料间变异性，但两个窝之间的SMN水平是可比较的，并且在所研究的每个组织中没有显着差异。这证实了SMA样小鼠中的SMN消耗在同一小鼠模型的小窝之间是可再现的。

在台湾SMA的模型被认为是严重的疾病的模型，其特点是病程进展快，导致周围P9死亡。然而，对于SMN表达的要求被认为在出生后期间大大改变至P20。因此，我们还想在SMA：Smn2B/-小鼠的中间小鼠模型中研究SMN蛋白水平（图1B，右图）。该模型是基于小鼠的外显子7的外显子剪接增强子区的三碱基对置换的Smn（下文称作为所述的Smn2B等位基因），其导致SMN2样mRNA的剪接。至于SMN2，其大部分蛋白质产物被截短并迅速降解。通过培育具有杂合Smn+/-小鼠的Smn2B等位基因（Smn2B/2B）纯合的小鼠来产生Smn2B/-小鼠。这导致实验性凋落物由~50%Smn2B/+对照和~50%Smn2B/-SMA样小鼠组成。出生时，Smn2B/-小鼠与同窝小鼠无法区分，症状发展始于P10。在此之后，Smn2B/-老鼠的体重增加与对照同窝小鼠相同。周围P15开始，的Smn2B/-小鼠显示在神经肌肉接头处的广泛病理，其特征在于，去神经，突触前的肿胀和差端板成熟。Smn2B/-小鼠的平均存活率取决于遗传背景。因此，对于目前的实验，我们将P5定义为症状前，P10为早期症状，P15为晚症状。

首先，由于Smn2B/-模型的时间过程与台湾模型的时间过程有很大不同，我们重复了实验，我们确定了控制同窝仔中的SMN水平（Smn2B/+，鼠标Smn的一个副本和一个副本）的的Smn2B等位基因）在P5，P10和P15的疾病相关的时间点。正如在台湾模型的分析中，我们使用脑，脊髓，肌肉（M.gastrocnemius），心脏，肝脏和肾脏，其中我们通过归一化荧光TPS确定SMN蛋白质水平，随后使用内部蛋白质标准品对膜之间的SMN表达进行归一化，所述内部蛋白质标准品一式三份分析并且每个组织和每个时间点进行三次生物学重复（图2，图A和B以及补充材料，图S）。在SMA的Smn2B/-模型中，我们发现年龄对SMN表达的影响显着依赖于所研究的组织，反之亦然，组织对SMN表达的影响显着依赖于所研究的年龄（P?0.，补充材料，表S1）。在除肝脏外的所有组织中，SMN水平从P5显着降低至P15，然而，在所有时间点，脑和脊髓中的SMN水平仍显着高于其他组织。在其他组织中，SMN在P5和P10之间降低，并且从P10到P15保持更恒定。肝脏SMN表达显着低于P5处的所有其他组织并且随时间保持相对恒定。

图.对照小鼠和Smn2B/-SMA小鼠SMN表达分析。（A）在指定组织中使用蛋白质印迹测定SmN2B/-SMA模型的对照同窝仔畜（Smn+/-;Smn2B/-）中的SMN表达。显示的是Int。对于所有组织都是相同的St.并且在每个膜上一式三份加载，并且在每个指定时间点（P5，P10和P15）对每个组织进行SMN表达。（B）来自（A）的所有组织中SMN表达的定量。首先将表达标准化为荧光TPS，然后归一化为Int。St.，允许膜之间的直接比较（n对于每个指定时间点的每个组织，=个生物学重复，±SEM）。（C）对于对照（Smn+/-;Smn2B/-）和SMA（Smn-/-），在症状前，早期和晚期症状年龄（P5，P10和P15）显示每种指定组织的SMN表达。;Smn2B/-）小鼠。（D）在每个时间点对每个组织中相对SMN消耗的定量。首先将每个样品中的SMN表达标准化为荧光TPS。相对于对照，显示SMA同窝仔畜中的SMN表达。

在确定对照SMN水平后，我们继续研究SMA同窝小鼠的所有六个组织中每个时间点的SMN消耗程度（图C和补充材料，图S4）。总体而言，SMN表达的相对降低在所有组织中相似（图D和补充材料，表S2）。相对SMN水平均为P5对照水平的~20%，然后随时间显着降低至P15对照的~10%（对于百分比，也参见图4C）。然而，有趣的是，我们没有观察到每个时间点组织之间的显着差异。这些结果表明，在Smn2B/-在SMA模型中，SMN表达的类似变异发生在对照小鼠的组织之间，但SMA小鼠中的SMN消耗在组织之间比在台湾模型中更具可比性。有趣的是，台湾模型中的系统病理学比Smn2B/-模型更为明显，这些发现支持这种可变性至少部分是由于SMN表达的可变性这一观点。

图4.台湾和Smn2B/-SMA模型的SMN水平比较。（A）在两种小鼠模型中，在P5的指定组织中通过蛋白质印迹测定SMN表达。显示的是Int。对于每个组织相同的St.并且在每个膜上一式三份加载，并且对于每个组织，SMN表达一式三份。kDa：40kDa分子量标记。（B）从（A）中的印迹定量SMN表达，*P0.05（t-测试）。首先将表达标准化为荧光TPS，然后归一化为Int。St.，允许膜之间的直接比较。（C）在每个研究的时间点和组织的两个小鼠模型中的剩余SMN水平的平均值（±SD）。（D）台湾小鼠中SMN表达随时间的相对消耗。为了使组织之间更容易比较，将P2设定为0，并且相对于P2显示P5和P8处的表达值。（E）Smn2B/-小鼠中SMN表达随时间的相对消耗。为了便于组织之间的比较，将P5设定为0，并且相对于P5显示P10和P15处的表达值。

接下来，我们想更详细地研究两种模型之间SMN表达的可能相似点和不同点。首先，我们需要通过在单个实验中确定来自两个模型的P5组织中脑，肾和肝中的SMN水平来直接比较两个小鼠模型中的SMN表达。如前所述，SMN水平归一化为TPS，随后归入内标以解释膜之间的变异性（图4A和B以及补充材料，图S5）。我们发现，在P5，虽然与台湾人相比，Smn2B/-肝脏蛋白质水平显着降低（P?=0.01）小鼠，两种小鼠模型中的SMN水平在所研究的每种组织中都是高度可比的。

这一发现使我们能够对台湾和Smn2B/-模型中SMN蛋白水平的差异和相似性进行多次观察。首先，在来自两种模型的对照组织中，脑和脊髓中的SMN水平显着高于其他组织中的SMN水平。此外，与其他外周组织相比，肾脏中的SMN表达高。虽然在与台湾模型（P2-P8）相关的时间过程中，SMN表达在对照动物中仍然增加，但对Smn2B/的分析-时间过程表明，在P10附近，SMN要求开始下降，并且在所有组织中P15SMN水平低于P5。令人惊讶的是，当研究SMA同窝小鼠中的SMN水平时，台湾小鼠组织之间的相对SMN消耗显着不同，但在Smn2B/-小鼠中相应地降低（图4C）。此外，当更详细地研究SMN表达随时间的变化时（图4D和E），我们注意到在台湾小鼠中，脊髓和脑相对SMN表达在P2和P5处相当，但随后在P5和P8之间急剧下降。，与该模型中的疾病发作和进展一致。在Smn相比之下，2B/-小鼠的SMN水平在组织中是相当的，与在该模型中观察到的更适度的疾病过程相匹配。提供本文所包含的补充数据和表格，以便研究人员在组织和时间点之间进行进一步的比较。由于SMN的消耗是SMA中观察到的所有途径和病理的核心，因此这些结果可为进一步研究提供一个起点，有助于回答SMA研究中仍存在的基本问题。

讨论

我们在此提供了健康对照小鼠以及两种已建立的SMA小鼠模型中不同组织和不同发育时间点的SMN蛋白表达变异的全面概述。由于使用稳健的方法确定SMN水平，我们能够在严重和中间SMA模型之间进行直接和可靠的比较。我们发现，在对照组织中，SMN水平在组织和时间点上变化很大，但在两种小鼠模型之间是相当的。然而，来自相同型号的SMA同窝仔的相对SMN水平差异很大。此外，在CNS组织中发现SMN表达水平始终较高，表明与非神经组织相比，神经组织中SMN的需求更高。

在先前的几项研究中已经报道了SMN蛋白水平（总结在表1中）。所用免疫印迹以确定在SMA患者SMN水平最初的研究经常采用了各种样对照和小样本号码，以及由此获得的SMN水平大的变化，因此很难解释。试图确定SMN水平随时间和在许多组织中的研究数量非常有限，并且再次使用不同的技术[免疫印迹，SMN-电化学发光（SMN-ECL）和酶联免疫吸附测定（ELISA）]很难直接比较它们。此外，一些研究集中于确定外周可及组织和患者细胞系中的SMN水平，例如血液，成纤维细胞和诱导多能干细胞（iPSC）来源的运动神经元，包括研究允许确定相对较大组中SMN水平的技术。这些研究主要用于药物和生物标志物研究，全血或血液来源细胞（如淋巴母细胞和外周血单核细胞（PBMC））中的SMN水平变化相当广泛，似乎部分取决于用于确定SMN水平的技术。我们目前的工作通过跨组织，时间点和小鼠模型进行标准化的蛋白质印迹定量方法克服了以前研究中存在的问题，从而使我们能够得出关于正常小鼠发育期间SMN蛋白表达的更有力的结论以及SMA同窝小鼠中的SMN蛋白。这是我们理解SMN的时间和组织要求的重要进步。

有趣的是，我们发现两种模型中对照小鼠的SMN表达相似，而相反，SMA同窝小鼠中保留的SMN水平差异很大。推测这种现象的基础是有趣的。在先前的研究中，将野生型小鼠（具有小鼠Smn的两个等位基因）与对于Smn和SMA同窝小鼠半合子的小鼠进行比较。在这里，作者观察到SMA同窝小鼠中SMN的显着减少，但Smn+/+?和Smn+/-小鼠之间只有很小的差异。这意味着在控制条件下，SMN蛋白来源于一种野生型Smn等位基因对于大多数细胞类型是足够的，因此存在两个拷贝的SMN2（台湾模型）或小鼠衍生的突变异Smn等位基因（Smn2B/-模型）不会进一步显着影响SMN水平。然而，如在SMA小鼠中，所有全长SMN仅来源于SMN2和Smn2B/-等位基因，SMA条件下的SMN蛋白水平突出了SMN的差异处理和翻译。在不同组织中衍生自这些等位基因的mRNA。现在需要进一步的研究来确定构成这些差异的细胞机制，因为它们可以为提高SMN水平提供额外的治疗靶点。

虽然运动神经元是在SMA主要病理目标，其它组织也表现出受到影响，无论是在病人和动物模型。本研究进一步强调了系统性地存在大量SMN的情况。在研究SMA中特定组织的缺陷时，本文中提供的数据集提供了在整体SMN表达的上下文中解释结果的资源。此外，结果符合SMN要求的阈值模型，其中CNS组织对SMN的消耗比其他组织更敏感，如前所述。然而，我们的研究结果表明组织和小鼠模型之间可能存在显着的变异性，并且随着时间的推移表达发生相当大的变化，在解释在特定时间点从个体组织获得的结果时应该考虑到这种变化。未来的研究可能能够通过调查SMN表达对特定细胞类型，如脊髓运动神经元。

与种类繁多，其在SMA观察到全身性的缺陷线，已鉴定许多细胞途径由SMN。尽管这些发现为SMA的发病机制提供了重要的新见解，但为了真正促进我们对SMA的理解，寻找和鉴定SMA疾病过程的中心调节剂变得越来越必要。SMN在不同组织中的消耗是所有这些途径的核心，因此如本文所述，随着时间的推移更好地理解SMN表达可以为进一步研究提供一个起点。这些研究将有助于回答有关SMA发病机制的重要问题，这些问题将有助于进一步优化和开发当前和未来的治疗方法。

8年丰富临床服务经验

分子遗传学检验领导品牌

提供全技术平台解决方案

基于人工智能的生物信息分析体系

内容丰富贴近临床的检测报告

业内最短的报告周期

专业的遗传咨询服务体系

北京康旭医学检验所

海淀区杏石口路益园文创基地C区10号楼

-转

欢迎转载,转载请注明原文网址：http://www.hoqpm.com/zzyyy/10414.html