上海地区名孕妇脊髓性肌萎缩症携带者筛查研究

脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,SMA)是一种常见的常染色体隐性遗传性神经肌肉病,居儿童致死性常染色体遗传病的第二位[1]。儿童型SMA发病率为1/~1/[1],携带者频率为1/35~1/50[2]。该病临床特征为身体躯干和四肢近端骨骼肌发生渐进性、对称性肌无力和肌萎缩。根据患者发病年龄和临床表现的严重程度，SMA分为四种临床型，其中儿童型包括三型：SMAⅠ型（OMIM）为最严重的急性型，通常于出生后6个月内发病，不能坐立，两岁内死亡；SMAII型(OMIM)为慢性婴儿型，6-18个月发病，能坐但不能行走，生存期超过两岁；SMAIII型(OMIM)为青少年型，多于18个月后发病，曾经会走，可存活至成人。SMAIV型(OMIM)为成人型，常于35岁后起病，起病与进展隐匿，以肌无力为主，预后相对良好。

以上几种类型的SMA致病基因均为位于5q13的运动神经元生存基因(survivalmotorneuron，SMN)，人基因组有二个紧邻的高度同源的SMN基因:端粒侧的SMN1和着丝粒侧SMN2，两者仅有5个碱基不同。SMN1是主要功能基因，SMN2为修饰基因(对病情严重程度起一定缓解作用)，目前已知95％的SMA患者为SMN1基因纯合缺失所致，少数病例可由SMN1基因点突变或小的缺失引起。

由于该病的携带者频率较高，突变热点明确，利于进行SMA携带者的人群筛查,通过筛查可以确认该病无症状的携带者,当夫妻双方均为携带者时可对其进行遗传咨询,评估出生患儿的遗传风险,并且可以通过产前诊断技术指导优生,降低人群中SMA患儿的出生率。

准确检测SMN1／SMN2拷贝数是SMA携带者筛查和临床确诊的重要手段。欧美人群的SMA分子遗传学研究已甚为深入，但有关中国人群的SMA相关研究，主要是由中国台湾苏怡宁教授应用变性高效液相色谱技术(denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC)对名台湾地区孕妇进行的SMA携带者筛查工作。目前尚缺乏中国大陆地区大人群SMA携带者筛查的遗传流行病学资料。本研究对名中国上海地区的孕妇进行SMA携带者的筛查，根据我们的实验结果可以预测中国上海地区SMA的携带者频率。

1材料与方法：

1.1样本收集

对于本研究参加SMA流行病分子调查的孕妇人群，进行相关的遗传咨询，本着自愿的原则，在签署知情同意书后采集其外周血样本，所有样本均取自上海长宁区妇幼保健院，采集时间从年11月29日到年3月28日，共例，其中≤19岁的样本1例（0.02%）；20-29岁样本例（54.2%）；30-39岁样本例（45.2%）；≥40岁样本27例（0.58%）。

1.2方法

1.2.1DNA提取

收集3mL外周全血,采用EDTA抗凝,应用宝生物公司全血DNA提取试剂盒(UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0)提取DNA。采用分光光度计检测DNA浓度,统一DNA浓度为50ng/μl,4℃保存备用。

1.2.2多重PCR-DHPLC分析

SMN基因及其内参KRIT1（MIM﹟）、CYBB（MIM﹟）基因的引物参照苏怡宁教授的相关文献[1]，多重PCR反应体积50ul，含ng模板DNA，KRIT1和CYBB每对引物0.04μM，SMN1和SMN2引物0.2μM，dNTPs终浓度μM，Taq酶1.5U，定量PCR反应的条件标准化为进行26个循环，

95℃,10min；（94℃,30sec；53℃,45sec；72℃,45sec）x26cycles；72℃,10min。

所有样品的目的基因拷贝数测定均采用基于DHPLC半定量的方法进行，其

PCR-DHPLC半变性突变检测法用于SMNl：SMN2比值的测定，MutiplexPCR产物上样后，通常目的峰形为4个峰，前2个是内参峰，后两个峰代表是SMN2、SMN1。WAVEMAKER软件自动测量每个基因产物峰的高度。PCR产物分析时设定为参照峰，其它峰定为检测峰。正常对照组求出检测峰（controlintendedpeak，Ci）与参照峰（controlreferencepeak，Cr）比值（Ci／Cr），样品组求出检测峰（patientintendedpeak，Pi）与参照峰（patientreferencepeak，Pr）的比值（Pi／Pr），按公式求得（Pi／Pr）÷（Ci／Cr）值，评估基因检测SMN1及SMN2基因拷贝数，并观察其变异范围。（Pi／Pr）÷（Ci／Cr）值校正后约等于1．0，则分析的基因外显子正常（双拷贝）；如得到的数值约等于0．5，则提示检测的基因外显子（Pi）存在杂合性缺失；如得到的数值大于2．0，则提示检测的基因外显子拷贝数存在异常重复。

2结果：

从年11月29日到年3月28日，共例来自上海长宁区妇幼保健院的孕妇进行了SMA携带者的筛查，其中例（99.4%）年龄在20-39岁之间。我们应用多重PCR-DHPLC技术对所有被测样品的SMN基因拷贝数进行了全面鉴定，在份标本的DHPLC定性筛查结果中，除74份异常峰型外，有份为正常峰型。SMA携带者为SMN1杂合缺失或转换的个体，即SMN1拷贝数为1。在份样品中共检测出SMA携带者90例，包含以下五种比值的个体：SMNl：SMN2=1：1样品15例，SMNl：SMN2=1：2样品41例，SMNl：SMN2=1：3样品26例，SMNI：SMN2=1：4样品4例和SMNl：SMN2=1：0样品4例（图1），人群携带者频率为1.9％，其中由于SMN1缺失形成的携带者(SMN1：SMN2=1：1和SMN1：SMN2=1：2)占1.2%；由于SMN1基因转换成SMN2基因形成的携带者（SMN1：SMN2=1：3和SMNI：SMN2=1：4）占0.6%。在本研究中还发现4例SMA携带者仅有1个拷贝SMNI和0个拷贝的SMN2。

图1.SMA携带者多重PCR-DHPLC峰型图

图示：蓝色为正常对照（SMN1外显子7的拷贝数为2）的峰型图，红色为检测样本的峰型图。a:SMNl：SMN2=1：1的SMA携带者；b:SMNl：SMN2=1：2的SMA携带者;c:SMNl：SMN2=1：3的SMA携带者;d:SMNl：SMN2=1：4的SMA携带者;e:SMNl：SMN2=1：0的SMA携带者.

我们选取了74个异常峰型样本中的21例，进行了直接测序，验证了异常峰型的产生是由于碱基改变所引起，由于SMN1基因和SMN2基因高度同源，这些碱基变异是发生在SMN1还是SMN2，是单核苷酸片段多态还是致病基因的微小突变，还需进一步用其他实验方法验证。

3讨论：

脊髓性肌萎缩症是一种源于脊髓前角细胞变性引起肌无力和肌萎缩的神经系统疾病，是婴幼儿期常见的致死性常染色体隐性遗传病。其携带者频率在不同人群中高达1/35-1/50,是出生缺陷的高危因素。

SMA的致病基因为SMN1基因，SMN1缺失是引起脊髓性肌萎缩症的主要原因，约95%患者表现为SMN1基因缺失，其余可呈SMN1基因微小突变［10］。由于该病严重危害人类健康，并且突变热点明确，人群中携带者比例较高，因此欧美等国家很早就建议在普通人群中进行SMA携带者的筛查。5年中国台北的苏怡宁等应用多重PCR结合DHPLC技术进行台湾地区SMA的携带者筛查，该技术除了定性分析SMN基因外，还可以定量分析SMN基因的拷贝数，与其他基因筛查技术相比，DHPLC具有敏感性高，自动化程度高和高通量等特点，非常适合大样本的筛查。该技术的发现，在准确检测SMA携带者的同时，极大地降低了检测的成本，使SMA携带者在大规模普通人群的筛查成为可能。

本研究应用上述的多重PCR结合DHPLC技术，通过分子流行病学调查对中国上海地区例怀孕妇女进行了SMA携带者筛查，阐明了该地区SMA的携带率、SMN1：SMN2基因比值及其分布情况。通过对份样品的筛查，共检测出SMA携带者90例，根据我们的结果预测中国上海地区怀孕妇女人群SMA携带者频率为1.9％，低于西方国家1/40的SMA携带者频率，中国台湾地区2.2%及韩国的2.13％的SMA携带者频率34。高于中国香港1．6％的SMA携带者频率33。在我们所检测到的90例SMA携带者中，由于SMN1缺失（SMN1：SMN2=1：1和SMN1：SMN2=1：2）产生的携带者为56例，占携带者总数的62.2%；由于SMN1转换（SMN1：SMN2=1：3和SMNI：SMN2=1：4）产生的携带者为30例，占携带者总数的33.3%；还有4例携带者为仅有1个拷贝的SMNI，0个SMN2，占携带者总数的4.5%。由于SMN2基因被普遍认为是SMA的修饰基因，其拷贝数与疾病的严重程度显著相关，SMN2拷贝数多得个体病情相对较轻。因此，在筛查SMA携带者的同时，精确鉴定SMN1和SMN2的拷贝数可以为今后的遗传咨询工作提供理论依据，也为探讨致病的分子机制提供有力的线索。

另外，人群中有少数携带者是SMN1“2+0”型（两个SMN1基因位于同一条染色体，另一个同源染色体缺失SMN1基因）和SMN1突变所致(1+1D)，我们目前的检测方法无法准确地检测这部分携带者，这也是今后要解决的问题。

我们开展这项分子流行病调查可以筛查中国上海地区怀孕妇女中SMA的携带率，后续拟进行SMA携带孕妇其配偶的检测，若夫妻双方均为携带者，通过提供高危携带夫妇胎儿的产前诊断等系列遗传咨询工作，有效地降低了该地区SMA患儿的出生率，对当地人群水平预防和人口优生优育起一定指导作用。本研究是国内首先完成的中国上海地区怀孕妇女的大样本SMN基因分子筛查，对于预防SMA患儿的出生，降低SMA的发病率，减轻家庭的经济负担、精神压力以及社会负担是十分重要的。