als相关的tdp43及fus蛋白的发现是als研究的一个重大事件和转折点由于大部分als患者存在tdp-43、fus蛋白的累积,als被认为是一种蛋白病,成为有特殊蛋白聚集的变性病的新成员含有tdp43及fus的包涵体代表als存在rna蛋白加工功能缺陷,只前已发现的als相关的基因中除tardbp及fus外神经源性肌萎缩还有4个与rna处理基因(senataxin、anglogenin、危险因子enlongator protein 3、运动神经元生存基因)有关由此启动、加速了变性病以rna加工为方向的发病机制研究,即研究蛋白修饰,蛋白与蛋白、蛋白与rna之间的相互作用,研究转录、转录后蛋白处理如剪接、mrna稳定、转运、翻译和rna降解,不仅能了解rna代谢通道改变的原因和机制,也将继续发现更多的疾病蛋白,进一步阐明als的发病机制

二、认识als疾病蛋白tdp-43及fus,开展als发病机制新通道的研究

三、认识tdp-43及fus蛋白病的临床表型及病理学特点,加强对als异质性的了解

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic l神经痛性肌萎缩ateral sclerosis, als)为一种累及皮质、皮质脊髓束、脑干、脊髓运动神经元的神经变性病,临床表现为四肢及躯干肌肉萎缩,导致运动功能严重障碍甚至呼吸肌麻痹,患者多于3-5年内死亡据统计其发病率为(1.5-2.5)/10万,5%-10%为家族性als(fals).其余90%以上为散发als(sals)该病距首例报道至今已有147年,直到近18年才取得了重大进步:1993年有学者发现部分fals患者有cu/zn超氧化物歧化酶(sod1)基因突变,开始了als分子生物学研究的新时代;2006年又发现绝大多数sals患者神经元和胶质细胞内有反式激活反应(tar)-dna结合蛋白43(tar dna binding protein-43,tdp43)包涵体,找到了主要疾病蛋白;2009年有学肌萎缩侧索硬化遗传者发现als有fus(fused in sarcoma protein/translocated in liposarcoma,也称fus/tls)基因突变,tdp-43阴性及阳性的als有fus包涵体,从而提出了als为tdp-43及fus蛋白病的新观点,并使研究方向移向了rna加工的领域但是对于tdp-43及fus蛋白累积的性质、神经元毒性机制及累积蛋白间的相互关系还缺乏足够认识,大部分als突变基因尚未找到国内虽已有相关的文献复习及sod1、senataxm基因、风险snp、cyp2e1基因多态性分析的论著,但有关蛋白病研究报道尚少现就als近年进展的主要观点及研究方向的个人认识作一介绍

sodi是在1973年被发现的面肌萎缩能治好抗氧化蛋白,由154个氨基酸组成,相对分子质量34 000,sod1基因定位于21号染色体,含5个外显子15%-20% fals、3% sals有sod1基因突变(称为mtsod1-als),是fals中一个最大的亚组,大约有150个不同的突变位点其发病机制目前已作了广泛研究,虽远不十分清楚,但可确定的是其机制并非酶活性丧失,而是毒性蛋白功能放大:(1)由于邻近神经元的胶质细胞突触处谷氨酸转运体(eaat2)缺陷,使释放的神经递质谷氨酸不能及时得到清除,产生毒性作用,运动神经元兴奋性过度升高,受体反复激活,细胞内钙离子超载引发中毒性的级联反应; (2) mtsod1形成错误折叠蛋白,聚集在病变细胞的内质网,发生应激反应,或与调节内质网应激的换能器及其识别体系的3个定位脊肌萎缩症的治疗于内质网的跨膜蛋白ire1(inositol-requiring protein-1)、perk(pkr-related er kinase)、atf6(activating transcription factor-6)、内质网内腔多肽链结合蛋白相互作用,抑制内质网相关的降解,产生内质网应激(但内质网应激为一加速疾病进展或终末期的因素,并不启动疾病);(3) mtsod1聚集物累积于线粒体(特别是脊髓细胞的线粒体)的膜间隙,导致线粒体结构和功能损害,线粒体钙离子缓冲能力、atp、能量障碍,融合、裂殖能力下降,线粒体蛋白成分改变、输入蛋白量下降;mtsodi毒性使轴突转运中细胞骨架蛋白结构变化,动力蛋白及动力蛋白激活蛋白聚集,顺脊髓进行性肌萎缩向或逆向的轴突转运减慢;(4) mtsod1抑制细胞质内蛋白酶体降解通路,抑制错误折叠蛋白的清除;mtsod1产生细胞外的超氧化物,增加氧化还原应激;(5)细胞内或外的mtsod1通过不同途径增加活性氧自由基的产生和释放,使小胶质细胞产生炎性细胞因子的级联反应,使运动神经元对谷氨酸中毒易感,抑制星形胶质细胞eaat的功能和表达,进一步加重神经毒性

四、认识tdp-43及fus蛋白细胞内累积的机制及相互关系,探索als早期诊断和有效治疗的新靶点

:雨声

一、深入认识sod1基因突变的神经元毒性机制,研究不同类型神经元在als发病中的地位

近年来als研究取得的关键进步是发现了致病蛋白tdp43及fus在以往研究的基础上,人们应用生肌萎缩性侧索硬化、免疫组织化学方法证实als及额颞叶痴呆-als(ftld-als)的变性运动神经元内的泛素化包涵体为tdp-43蛋白,进一步的研究发现该蛋白存在于90% sals患者的尸检脑和脊髓组织,因此认为tdp-43为als的疾病蛋白,泛素包涵体因此改名为tdp43包涵体tdp-43是ou等在研究hiv-1基因表达中发现的1个广泛表达的核调节蛋白,由414个氨基酸组成,具有2个rna识别模体(rrmi、2),n端有核定位信号(nls),c端有甘氨酸富集区,能结合dna、rna,穿梭于胞质与核内,有高度保守性,可调节转录、剪接、rna加工、细胞凋亡、细胞分裂、mrna的稳定,参与神经元完整性和可塑性调节,广泛分布于各种组织,定位于核内,神经系统内位患肌萎缩侧索硬化症于神经元、胶质细胞、树突,控制rna转录的剪接编码tdp43的基因tardbp位于1号染色体,为一必须有的生存基因,在动物实验中发现tdp43完全缺失时胚胎不能存活,条件缺失时产后死亡,杂合的动物出现运动功能障碍,有明显的年龄依赖性,即早期不表现症状,老年后出现症状目前已发现30个不同的tardbp基凶突变,多累及甘氨酸富集区,但突变基因检出频率较低,fals检出的频率只有3%-5%,sals的频率为0.4%-1.5%,总的突变率为2.7%

尚应指出als中有占总体的6%(fals的10%-20%)是因sod1基因突变引起的,与tdp43或fus蛋白病互相排斥虽然sod1-als突变体的错折蛋白在发病中也有作用,少数为不溶性蛋白的包涵体,可累及rna加工,但大部面肌萎缩图片分为可溶性蛋白聚集,说明sod1-als有独立的发病机制;而其余als均有tdp-43或fus蛋白累积,但是否只局限于这2个蛋白以及是否还存在其他的机制,尚不清楚,加以目前70% als的致病基因尚未找到,因此als的发病可能是多机制或者是异质性的,仍然需要进一步探索和认识

因此tdp43及fus蛋白病的发现拓广了对als临床表型的认识,长期来临床上对孤立的运动神经元病、青年型脊髓型肌萎缩以及以颈肌及近端肌肉发病的下运动神经元病的分类及归属常感困难,对als进程中表现的pma难以肯定诊断,tdp43与fus蛋白及其相关基因的突变确认了als表型的多样性,上述不典型表现或fus基因r521c突变的相关类型扩大了als的临床谱肌萎缩侧索硬化症状;同样对ftld亚型与als在临床、病理上的复杂重叠关系,找到了本质联系,tdp-43及fus蛋白是als及额颞叶变性的共同病理成分,根据临床表型和疾病蛋白成分可分出不同亚型:ftld-tdp、ftld-fus、ftld-tdp及fus, ftld-als-tdp、ftld-als-fus、ftld-als-tdp及fus不同联合的亚型代表了ftld与als临床病理相谱中的连续变化的不同点组合,因此als-ftld可考虑为als的重叠性疾病,或者是als的多系统表现同时tdp43及fus蛋白病还存在于其他神经变性病中,如见于guam als-帕金森病复合体、海马硬化性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病和le进行性脊肌萎缩症wy体痴呆、经典pick病、皮质基底节变性、machado-joseph病,fus蛋白病还可见于嗜酸性、嗜碱性包涵体病因此已不能将als简单认为是“选择性的运动神经元损伤”疾病,但是对于als表型的异质性及各型间的差别及界限尚不清楚,对als与相关疾病的重叠或重叠综合征尚无精确了解,对其病理性联结及致病蛋白与其他神经变性病的机制性联系有待于深入研究,因此,正确认识als疾病表现的多样性及加强异质性的研究必将进一步提高临床诊断水平

与fus蛋白相关的als的临床表型与上述大致相同,但一般认为发病年龄早、上运动神经元症状轻不典型als包括fus-lmnd及r52ic突变表型,常表现为脊髓性肌萎缩对称性的上肢近端肌肉力弱,以后累及远端,有的表现为对称性盆带肌、胸大肌,远端肌力弱,通常无延髓肌症状、认知改变,上运动神经元症状在疾病后期可出现或不出现,神经病理见到脊髓运动神经元严重丧失,脑干、皮质脊髓束、脑皮质运动神经元轻度改变r521c突变表型的发病年龄有年轻化倾向,有些患者有颈肌力弱的垂头综合征fus蛋白相关als的病理学特征为fus蛋白包涵体,形态及分布与tdp43大致相同,但核内常可见轻的免疫染色,大部分患者与tdp43共定位,部分患者无tdp43,只有fus蛋白包涵体,称为als-fus(nontdp43);另外fus蛋白尚见于具有嗜碱性包涵体的青年型als及中间丝包涵体的als,有认为是als的特殊类型脊髓性肌萎缩症als相关疾病包含als(痴呆)-fus、额颞叶变性,额颞叶变性-fus(nontdp-43)者称为不典型ftld

tdp-43蛋白病的临床表型为经典的成人型als,包括无mtsod1的fals及sals、孤立的运动神经元病(mnd)或下运动神经元病(lmnd)、进行性肌萎缩(pma) 、guam-als,另有1例感觉、运动性神经病(但不排除合并有mnd)报道;其相关疾病有额颞叶变性、ftld-alspamphlett报道的pma、geser等报道的lmnd和pma只有轻的皮质病理改变,认为pma及lmnd可能是als的亚型,应包括在als及ftld-als内与tdp-43相关的als的病理学特征为tdp-43蛋白包涵体,通常分布于运动皮肌萎缩侧索硬化预防质神经元、胶质细胞、神经突,聚集物呈细丝状、圆形、颗粒状、线串状,分布于胞质,与泛素、p62蛋白共定位,但与半胱氨酸蛋白酶蛋白c、磷酸化tau蛋白、α-突触核蛋白及磷酸化的神经丝蛋白不相关,可见于sals、als-痴呆、无sod1突变的fals

fus与tdp43均为功能结构相似的核内多功能蛋白,病变时被扣留在胞质内,部分als与ftld患者无tdp-43包涵体,只有fus包涵体,这种现象称为als-fus与ftld-tdp43不重叠,说明fus蛋白亦为独立类型有认为是由于tdp43与fus是2个不同类型、相关的rna颗粒,fus与应激颗粒有关,而tdp-43与加工体有关,均参与应激反应关于2个蛋白间的功能关系,是治疗肌萎缩医院排名否是相关蛋白、多功能蛋白还是组成复合体共同发挥作用,尚不十分清楚,它们的共同生化通路或共同启动的生化过程尚不了解

由于als临床表现的异质性及其疾病发展阶段的不同表现,早期诊断存在困难,tdp43及fus蛋白的发现为诊断als提供了新的生化标志noto等测定了27例als患者脑脊液中的tdp43蛋白,并与50例神经变性病及炎性疾病比较,发现只有als患者脑脊液tdp43蛋白升高,敏感度达59.3%,特异度达96.0%,而低水平的tdp-43患者存活时间缩短,因此脑脊液tdp43蛋白为一诊断als有潜力的生化标志foulds等测定了ftld患者的血浆内磷酸化tdp-43蛋白,并与脑tdp-43病理学比较,发现两者明显相关,可能有潜在的诊断价值tdp治疗肌萎缩-43及fus蛋白的发现增加了探索治疗als的新靶点,虽然对抗谷氨酸毒性通道的治疗研究远未深入(有称为“盖子未完全打开”).但对疾病机制的新认识增加了治疗靶点,扩大了新的治疗研究方向,如可研究恢复核定位信号、转运体介导的入核功能,抑制细胞内蛋白聚集、改善蛋白加工中的剪接、转录失调,改善胞核及胞质蛋白穿梭功能,抗神经炎性、抗凋亡,以及根据als的非细胞自主性变性原则,在疾病不同阶段选择治疗靶点,也将提高有效性

mtsod1-fals的相关研究发现als主要病变在运动神经元,但发病及疾病进展的原因并非运动神经元本身,而是由不同类型的神经元共同参与,各自作用不同,因而提出了细胞非自主性功能(n患肌萎缩侧索硬化症on-cells-autonomous function)的机制(或称非细胞自主变性)一般认为星形胶质细胞在疾病的启动或进展中有重要地位,而小胶质细胞在终末期有致炎及清除变性细胞的功能,施万细胞的表达可使病程减慢,肌肉、上皮细胞的表达不影响发病和疾病的进展g85r、g37r转基因小鼠的运动神经元、中间神经元、胶质细胞、小胶质细胞敲除突变基因实验,证实了不同类型细胞在疾病过程中的上述地位对mtsod-g93a小鼠症状前期、症状期、晚期、濒死期的对比观察发现,症状期运动皮质、脊髓、三叉神经运动核星形胶质细胞增生增加,而晚期、濒死期脊髓、三叉神经运动核以及濒死期小鼠的丘脑腹侧星形胶质细胞增生增加,伴运动神经元死亡增加进行性脊髓肌萎缩症,而小胶质细胞激活增加仅出现在濒死期,提示星形胶质增生先于运动神经元变性或同时出现,而小胶质细胞增生发生晚,出现在运动神经元变性后这些实验均证明了星形胶质细胞在调节运动神经元非细胞自主变性中有重要地位,因此深入研究sod1毒性发病复杂机制,探索与sod1毒性关联的细胞非自主机制,阐明不同细胞类型在发病中的地位,对于延缓疾病发生、减慢进展的治疗措施的研究有十分重要的前景

tdp43及fus蛋白在细胞内的累积包括2个过程,即蛋白的错定位和蛋白在胞质累积并形成包涵体,其分子机制尚不十分清楚,但与蛋白错定位及入核通路缺陷有关核定位信号顺序缺失、核rrm缺乏、核转运体系本身缺陷或tdp43蛋白翻译后不能与转运体系有效结面肌萎缩图片合、蛋白酶体降解抑制均可导致tdp-43在胞质的错定位igaz等制作的表达核定位信号损伤的tdp-43转基因小鼠出现了tdp43胞质错定位,神经元丧失、皮质脊髓柬变性,类似ftld和原发性侧索硬化表现;nishimura等应用sirna沉默核转运蛋白82以及敲除入核因子核质蛋白karyopherin-β1、细胞凋亡敏感蛋白,使胞质内tdp-43明显累积;而tdp-43相关ftld患者的尸检脑及als的脊髓标本中,细胞凋亡敏感蛋白表达降低胞质内累积的蛋白多为截断的tdp-43片段,相对分子质量常约35 000或25 000,可结合全长的tdp43或其他蛋白形成1个或几个复合体,因此tdp-43 c末端磷酸化、裂解化、片段化作用以及突变基因均可使蛋进行性脊肌萎缩白在胞质内累积并形成包涵体累积物损伤神经元的机制尚不十分清楚,有可能是聚集后启动共聚集,结合全长tdp-43,使核内功能性tdp43减少或结合伴侣蛋白形成无功能蛋白复合物,通过显性,阴性机制形成神经毒性,神经分化过程中损伤轴突生长fus蛋白相关的als由于缺乏动物模型,其胞质内累积及导致神经变性的机制更不清楚,最近的研究认为fus蛋白c端运输活性丧失、入核体系损伤导致胞质错定位,并组装入应激颗粒,提示翻译调节、mrna代谢中断可产生不适当的过量的应激颗粒

2009年研究者又发现als患者的tdp43包涵体内存在fus蛋白fus蛋白最早是作为原癌基因融合成分从1个有染色体易位的脂肪肉瘤中分离的,系526个氨基酸组成的多功能d肌萎缩症na、rna的结合蛋白,n末端有丝氨酸一酪氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺(sygq)富集区,有2个rgg重复、rrm、甘氨酸富集区、半胱氨酸锌指模体,c端有非经典的核定位信号区,在核内、胞质均有表达,可在胞内外穿梭,参与细胞增殖、dna修复、rna及mirna加工、转运、转录调节和维持基因稳定性,可维持神经元的可塑性、树突完整性‘4j编码fus蛋白的基因位于染色体16q12,有15个外显子,基因突变在fals中的发生频率为3%-5%,是仅次于sod1的fals亚组;但在sals中发生频率仅为0.6%-0.7%该基因目前已发现有35个突变,多为错义突变,大部分位于13-15外显子,编码精氨酸-甘氨酸-甘氨酸重复区及nls区,导致nls中断,核转运腓骨肌萎缩症治疗蛋白介导的入核途径损害,1/3突变位于编码sygq及甘氨酸富集区的3、5、6外显子,有报道称c端突变多见于fals,3、5、6突变多见于sals